Справочник вопросов и ответов
QUOR - электронный справочник

Модельный липидный бислой - Model lipid bilayer

Тег: Другие предметы

A модельный липидный бислой - это любой бислой, собранный in vitro, как в отличие от бислоя природных клеточных мембран или покрывающих различные субклеточные структуры, такие как ядро ​​. Они используются для изучения фундаментальных свойств биологических мембран в упрощенной и хорошо контролируемой среде и все чаще используются в восходящей синтетической биологии для создания искусственных клеток. Модельный бислой может быть изготовлен из синтетических или природных липидов. Самые простые модельные системы содержат только один чистый синтетический липид. Более физиологически релевантные модельные бислои могут быть изготовлены из смесей нескольких синтетических или природных липидов.

Существует много различных типов модельных бислоев, каждый из которых имеет экспериментальные преимущества и недостатки. Первой разработанной системой была черная липидная мембрана или «окрашенный» бислой, который позволяет просто определять электрические характеристики бислоя, но является недолговечным и с ним трудно работать. Поддерживаемые бислои прикреплены к твердой подложке, повышая стабильность и позволяя использовать инструменты определения характеристик, что невозможно в объемном растворе. Эти преимущества достигаются за счет нежелательных взаимодействий с субстратом, которые могут денатурировать мембранные белки.

Содержание

  • 1 Черные липидные мембраны (BLM)
  • 2 Поддерживаемые липидные бислои (SLB)
  • 3 Связанные двухслойные липидные мембраны (t-BLM)
  • 4 везикулы
  • 5 бислои на границе раздела капель
  • 6 мицеллы, бицеллы и нанодиски
  • 7 Ссылки

Черные липидные мембраны (BLM)

Схема эксперимента с окрашенным бислоем. Лист пластика с небольшим отверстием в центре разделяет камеру с двух сторон. Через это отверстие образуется бислой, разделяющий две камеры. Электрические свойства бислоя можно измерить, поместив электрод в каждую сторону камеры.

Первой разработанной модельной двухслойной системой был «окрашенный» бислой, также известный как «черная липидная мембрана». Термин «окрашенный» относится к процессу, с помощью которого создаются эти бислои. Во-первых, в тонком слое гидрофобного материала, такого как тефлон, создается небольшое отверстие. Обычно диаметр этого отверстия составляет от нескольких десятков микрометров до сотен микрометров. Для образования BLM область вокруг отверстия сначала «предварительно окрашивают» раствором липидов, растворенных в гидрофобном растворителе, путем нанесения этого раствора через отверстие с помощью кисти, шприца или стеклянного аппликатора. Используемый растворитель должен иметь очень высокий коэффициент распределения и должен быть относительно вязким, чтобы предотвратить немедленный разрыв. Наиболее часто используемый растворитель представляет собой смесь декана и сквалена.

. После высыхания отверстия в обе стороны камеры добавляют раствор соли (водная фаза). Затем отверстие «окрашивают» липидным раствором (обычно тем же раствором, который использовался для предварительной окраски). Монослой липидов спонтанно образуется на границе раздела между органической и водной фазами по обе стороны от капли липид / растворитель. Поскольку стенки отверстия гидрофобны, раствор липид / растворитель смачивает эту границу раздела, делая каплю в центре более тонкой. Когда две стороны капли подходят достаточно близко друг к другу, липидные монослои сливаются, быстро исключая небольшой оставшийся объем раствора. В этот момент в центре апертуры образуется двойной слой, но по периметру остается значительное кольцо растворителя. Это кольцо требуется для поддержания стабильности, действуя как мост между бислоем толщиной ~ 5 нм и листом толщиной 10 микрометров, в котором сделана апертура.

Термин «черный» бислой относится к тому факту, что они являются темными в отраженном свете, поскольку толщина мембраны составляет всего несколько нанометров, поэтому свет, отражающийся от задней поверхности, деструктивно мешает свету, отражающемуся от передней поверхности. Действительно, это был один из первых ключей к разгадке того, что с помощью этого метода была получена мембрана молекулярной толщины. Черные липидные мембраны также хорошо подходят для определения электрических характеристик, поскольку обе камеры, разделенные двухслойным слоем, доступны, что позволяет легко разместить большие электроды. По этой причине электрическая характеристика является одним из наиболее важных методов, используемых в сочетании с окрашенными липидными бислоями. Простые измерения показывают, когда образуется бислой и когда он разрывается, поскольку неповрежденный бислой имеет большое сопротивление (>ГОм) и большую емкость (~ 2 мкФ / см). Более продвинутая электрическая характеристика была особенно важна при исследовании ионных каналов, управляемых напряжением. Мембранные белки, такие как ионные каналы, обычно не могут быть включены непосредственно в окрашенный бислой во время формирования, потому что погружение в органический растворитель денатурирует белок. Вместо этого белок солюбилизируется с помощью детергента и добавляется к водному раствору после образования двойного слоя. Покрытие из детергента позволяет этим белкам спонтанно вставляться в бислой в течение нескольких минут. Кроме того, были проведены начальные эксперименты, которые сочетают электрофизиологические и структурные исследования черных липидных мембран. В другом варианте метода BLM, называемом двухслойным штампом, стеклянная пипетка (внутренний диаметр ~ 10-40 мкм) используется в качестве электрода на одной стороне двухслойного слоя, чтобы изолировать небольшой участок мембраны. Эта модификация метода patch clamp обеспечивает запись с низким уровнем шума даже при высоких потенциалах (до 600 мВ) за счет дополнительного времени на подготовку.

Основные проблемы, связанные с окрашенными бислоями, - это остаточный растворитель и ограниченный срок службы. Некоторые исследователи считают, что карманы растворителя, застрявшие между двумя двухслойными листочками, могут нарушить нормальную функцию белка. Чтобы преодолеть это ограничение, Монталь и Мюллер разработали модифицированную технику осаждения, исключающую использование тяжелого нелетучего растворителя. В этом методе отверстие начинается над поверхностью воды, полностью разделяя две камеры с жидкостью. На поверхности каждой камеры образуется монослой путем нанесения липидов в летучем растворителе, такого как хлороформ, и ожидания, пока растворитель испарится. Затем отверстие опускается через границу раздела воздух-вода, и два монослоя из отдельных камер складываются друг против друга, образуя бислой поперек отверстия. Решить проблему стабильности оказалось труднее. Обычно черная липидная мембрана выживает менее часа, что исключает долгосрочные эксперименты. Этот срок службы можно продлить за счет точного структурирования поддерживающей апертуры, химического сшивания липидов или гелеобразования окружающего раствора для механической поддержки бислоя. Работа в этой области продолжается, и срок службы составит несколько часов.

Поддерживаемые липидные бислои (SLB)

Схема поддерживаемого бислоя

В отличие от везикул или клеточной мембраны, в которых липидный бислой свернут в закрытую оболочку, поддерживаемый бислой представляет собой плоскую структуру, сидящую на прочной опоре. Из-за этого свободному раствору подвергается только верхняя грань бислоя. Эта схема имеет преимущества и недостатки, связанные с изучением липидных бислоев. Одним из самых больших преимуществ поддерживаемого бислоя является его стабильность. SLB останутся в значительной степени неповрежденными даже при высокой скорости потока или вибрации, и, в отличие от черных липидных мембран, наличие дырок не разрушит весь бислой. Из-за этой стабильности эксперименты длятся недели и даже месяцы возможны с поддерживаемыми бислоями, в то время как эксперименты BLM обычно ограничиваются часами. Еще одно преимущество поддерживаемого бислоя состоит в том, что, поскольку он находится на плоской твердой поверхности, его можно использовать для ряда инструментов определения характеристик, которые были бы невозможны или предложили бы более низкое разрешение, если бы они выполнялись на свободно плавающем образце.

Одним из ярких примеров этого преимущества является использование методов механического зондирования, которые требуют прямого физического взаимодействия с образцом. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) использовалась для визуализации липидного фазового разделения, образования трансмембранных нанопор с последующей адсорбцией одной молекулы белка и сборки белка с субнометровой точностью без необходимости краситель для этикеток. Совсем недавно AFM также использовался для непосредственного исследования механических свойств отдельных бислоев и для выполнения силовой спектроскопии на отдельных мембранных белках. Эти исследования были бы трудными или невозможными без использования поддерживаемых бислоев, поскольку поверхность клетки или пузырька относительно мягкая и будет дрейфовать и колебаться со временем. Другим примером физического зонда является использование микровесов из кристаллов кварца (QCM) для изучения кинетики связывания на двухслойной поверхности. Интерферометрия с двойной поляризацией - это оптический инструмент высокого разрешения для определения характеристик упорядочение и разрушение липидных бислоев во время взаимодействий или фазовых переходов, что дает дополнительные данные для измерений QCM.

Многие современные методы флуоресцентной микроскопии также требуют жестко закрепленной плоской поверхности. Методы Evanescent field, такие как флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR), могут предложить чрезвычайно чувствительное измерение связывания аналита и оптических свойств двух слоев. но может функционировать только в том случае, если образец опирается на специальные оптически функциональные материалы. Другой класс методов, применимых только к поддерживаемым бислоям, - это методы, основанные на оптической интерференции, такие как флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия (FLIC) и отражательная интерференционная контрастная микроскопия (RICM) или микроскопия интерферометрического рассеяния (iSCAT). Когда бислой поддерживается поверх отражающей поверхности, вариации интенсивности из-за деструктивной интерференции от этой границы раздела можно использовать для расчета с точностью до ангстрема положения флуорофоров внутри бислоя. Как метод кратковременной, так и интерференционной съемки предлагает субволновое разрешение только в одном измерении (z или вертикальное). Во многих случаях этого разрешения достаточно. В конце концов, бислои очень малы только в одном измерении. В боковом направлении двухслойный слой может простираться на многие микрометры или даже миллиметры. Но определенные явления, такие как динамическая фазовая перестройка, действительно происходят в бислоях на латеральном субмикрометровом масштабе длины. Перспективным подходом к изучению этих структур является сканирующая оптическая микроскопия в ближнем поле (NSOM). Как и AFM, NSOM полагается на сканирование микромашинного наконечника для получения сильно локализованного сигнала. Но в отличие от AFM, NSOM использует оптическое, а не физическое взаимодействие с образцом, потенциально нарушая тонкие структуры в меньшей степени.

Флуоресцентная микрофотография поддерживаемого бислоя на подложке, на которую нанесен узор загона. Затем на этот субстрат последовательно воздействовали двумя разными популяциями липидов (окрашенными в красный и зеленый цвета). Хотя популяции держали в значительной степени разделенными, на границе раздела наблюдалось некоторое перемешивание, что видно по цветовому градиенту.

Другой важной возможностью поддерживаемых бислоев является способность формировать узор на поверхности для создания нескольких изолированных областей на одной подложке. Это явление было впервые продемонстрировано с использованием царапин или металлических «загонов» для предотвращения смешивания между соседними областями, при этом позволяя свободную диффузию внутри любой одной области. Более поздняя работа расширила эту концепцию, интегрировав микрофлюидику, чтобы продемонстрировать, что стабильные градиенты состава могут формироваться в двухслойных слоях, что потенциально позволяет проводить массовые параллельные исследования фазовой сегрегации, молекулярного связывания и клеточного ответа на искусственные липидные мембраны. Творческое использование концепции загона также позволило изучить динамическую реорганизацию мембранных белков на синаптическом интерфейсе.

Одним из основных ограничений поддерживаемых бислоев является возможность нежелательного взаимодействия с субстрат. Хотя поддерживаемые бислои обычно не соприкасаются напрямую с поверхностью подложки, они разделены очень тонким водяным зазором. Размер и природа этого зазора зависит от материала субстрата и видов липидов, но обычно составляет около 1 нм для цвиттерионных липидов, нанесенных на диоксид кремния, наиболее распространенную экспериментальную систему. Поскольку этот слой очень тонкий, существует обширная гидродинамическая связь между бислоем и подложкой, что приводит к более низкому коэффициенту диффузии в поддерживаемых бислоях, чем для свободных бислоев того же состава. Определенный процент поддерживаемого бислоя также будет полностью неподвижен, хотя точная природа и причина этих «закрепленных» сайтов все еще не ясны. Для высококачественных бислоев, поддерживаемых жидкой фазой, неподвижная фракция обычно составляет около 1-5%. Чтобы количественно оценить коэффициент диффузии и подвижную фракцию, исследователи, изучающие поддерживаемые бислои, часто сообщают данные FRAP.

Нежелательные взаимодействия субстрата представляют собой гораздо большую проблему при включении интегральных мембранных белков, особенно тех, у которых большие домены выступают за пределы сердцевины бислоя. Поскольку зазор между бислоем и субстратом очень тонкий, эти белки часто становятся денатурированными на поверхности субстрата и, следовательно, теряют всю функциональность. Одним из подходов к решению этой проблемы является использование связанных с полимером бислоев. В этих системах бислой поддерживается на рыхлой сети из гидратированных полимеров или гидрогеля, который действует как спейсер и теоретически предотвращает денатурирующие взаимодействия с субстратом. На практике некоторый процент белков все еще будет терять подвижность и функциональность, вероятно, из-за взаимодействий с полимерными / липидными якорями. Исследования в этой области продолжаются.

Привязанные двухслойные липидные мембраны (t-BLM)

Использование привязанной двухслойной липидной мембраны (t-BLM) дополнительно увеличивает стабильность поддерживаемых мембран за счет химического закрепления липидов на твердой подложке

Диаграмма, показывающая образование t-BLM.

. Золото можно использовать в качестве субстрата из-за его инертного химического состава и тиолипидов для ковалентного связывания с золотом. Тиолипиды состоят из производных липидов, расширенных у своих полярных головных групп гидрофильными спейсерами, которые заканчиваются тиоловой или дисульфидной группой, которая образует ковалентную связь с золотом, образуя сам собранные монослои (SAM).

Ограничение внутримембранной подвижности поддерживаемых липидных бислоев можно преодолеть путем введения полумембранных связующих липидов с бензилдисульфидом (DPL) и синтетического аналога архей, полномембранных липидов с фитаноловыми цепями для стабилизации структуры и полиэтиленгликолевые звенья в качестве гидрофильного спейсера. Формирование бислоя достигается воздействием на покрытый липидами золотой субстрат липидов внешнего слоя либо в растворе этанола, либо в липосомах.

Преимущество этого подхода состоит в том, что из-за гидрофильного пространства около 4 нм взаимодействие с субстратом минимальна, а дополнительное пространство позволяет вводить белковые ионные каналы в бислой. Кроме того, разделительный слой создает ионный резервуар, который позволяет легко измерять электрический импеданс переменного тока через бислой.

Везикулы

Схема липидных везикул, показывающая раствор молекул (зеленые точки), заключенных во внутренней части везикулы.

Везикула представляет собой липидный бислой, свернутый в сферическую оболочку, заключающую в себе небольшое количество вода и отделение ее от воды за пределами пузырька. Из-за этого фундаментального сходства с клеточной мембраной везикулы широко используются для изучения свойств липидных бислоев. Еще одна причина, по которой везикулы используются так часто, заключается в том, что их относительно легко сделать. Если образец дегидратированного липида подвергается воздействию воды, он самопроизвольно образует пузырьки. Эти начальные везикулы обычно многослойные (многостенные) и имеют широкий диапазон размеров от десятков нанометров до нескольких микрометров. Такие методы, как обработка ультразвуком или экструзия через мембрану, необходимы, чтобы разбить эти начальные везикулы на более мелкие однослойные везикулы одинакового диаметра, известные как маленькие однослойные везикулы (SUV). Внедорожники обычно имеют диаметр от 50 до 200 нм. В качестве альтернативы, вместо того, чтобы синтезировать везикулы, можно просто изолировать их из культур клеток или образцов тканей. Везикулы используются для транспортировки липидов, белков и многих других молекул внутри клетки, а также внутрь или из клетки. Эти естественно изолированные везикулы состоят из сложной смеси различных липидов и белков, поэтому, хотя они предлагают больший реализм для изучения конкретных биологических явлений, простые искусственные везикулы предпочтительнее для изучения фундаментальных свойств липидов.

Поскольку искусственные внедорожники могут производиться в больших количествах, они подходят для исследований объемных материалов, таких как дифракция рентгеновских лучей для определения шага решетки и дифференциальная сканирующая калориметрия для определения фазовых переходов. Двойная поляризационная интерферометрия позволяет измерять однослойные и многослойные структуры, а также встраивание и разрушение везикул в формате анализа без метки. Везикулы также могут быть помечены флуоресцентными красителями, что позволяет проводить чувствительные анализы слияния на основе FRET. Несмотря на эту флуоресцентную маркировку, часто бывает трудно получить детальное изображение внедорожников просто потому, что они такие маленькие. Чтобы решить эту проблему, исследователи разработали гигантский однослойный пузырек (GUV). GUV достаточно большие (несколько десятков микрометров) для изучения с помощью традиционной флуоресцентной микроскопии. По этой причине многие из исследований липидных рафтов в искусственных липидных системах были выполнены с GUV. По сравнению с поддерживаемыми бислоями GUV представляют собой более «естественную» среду, поскольку поблизости нет твердой поверхности, которая могла бы вызвать дефекты или денатурировать белки. Тем не менее, GUV относительно хрупкие, на их изготовление уходит много времени, и их производство ограничено по сравнению с SUV. Сообщается, что для обхода этих проблем используется микрожидкостная сборочная линия для GUV. В качестве альтернативы SUV и их переход в бислой на твердой подложке можно визуализировать с помощью микроскопии интерферометрического рассеяния (iSCAT). Этот метод также позволяет обнаруживать микро- и нанодомены без меток.

Двухслойные интерфейсы капель

Двухслойные интерфейсы капель (DIB) представляют собой заключенные в фосфолипиды капли, которые образуют бислои, когда они помещаются в контакт. Капли окружены маслом, а фосфолипиды диспергированы либо в воде, либо в масле. В результате фосфолипиды спонтанно образуют монослой на каждой границе раздела масло-вода. DIB могут быть сформированы для создания тканеподобного материала, способного образовывать асимметричные бислои, восстанавливать белки и белковые каналы, или использоваться для изучения электрофизиологии. Расширенные сети DIB могут быть сформированы либо с помощью капельных микрожидкостных устройств, либо с помощью капельных принтеров.

Мицеллы, бицеллы и нанодиски

Моющие средства мицеллы - это еще один класс модельных мембран, которые являются обычно используются для очистки и изучения мембранных белков, хотя в них отсутствует липидный бислой. В водных растворах мицеллы представляют собой совокупности амфипатических молекул, гидрофильные головки которых подвергаются воздействию растворителя, а их гидрофобные хвосты находятся в центре. Мицеллы могут солюбилизировать мембранные белки, частично инкапсулируя их и защищая их гидрофобные поверхности от растворителя.

Бицеллы представляют собой родственный класс модельных мембран, обычно состоящих из двух липидов, один из которых образует липидный бислой, а другой образует амфипатическую мицеллоподобную сборку, защищающую центр бислоя от окружающих молекул растворителя. Бицеллы можно рассматривать как сегмент бислоя, инкапсулированный и солюбилизированный мицеллой. Бицеллы намного меньше липосом, поэтому их можно использовать в таких экспериментах, как ЯМР спектроскопия, где везикулы большего размера не подходят.

Нанодиски состоят из сегмента бислоя, инкапсулированного амфипатической белковой оболочкой, а не из липидного или детергентного слоя. Нанодиски более стабильны, чем бицеллы и мицеллы при низких концентрациях, и очень хорошо определены по размеру (в зависимости от типа белковой оболочки от 10 до 20 нм ). Мембранные белки, включенные в нанодиски и солюбилизированные ими, могут быть изучены с помощью широкого спектра биофизических методов.

Ссылки

296